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Desde 1997 en que fueron descritas las primeras mutaciones puntuales en el gen UBE3A en paciente Síndrome de Angelman (SA), éste es considerado un síndrome monogénico, es decir, alteraciones en un único en causan el síndrome. El gen UBE3A se encuentra en la región cromosómica 15q11-q13 sometido al fenómeno de impronta genética, por lo que dicho gen sólo es funcional en uno de los dos alelos. Se conoce que en ciertas regiones del cerebro y cerebelo la expresión del gen UBE3A es materna, por lo que alteraciones que afecten al cromosoma 15 materno pueden causar el SA. Las causas responsables son: una deleción de la región 15q11-q13 en el cromosoma materno en el 70% de los casos, una disomía uniparental paterna en el 3-5% de los casos, un defecto de impronta en el 2-5%, mutaciones puntuales en el gen UBE3A en el 10-15%, y en menos del 1% una reorganización cromosómica que implica a la región 15q11-q13. Cabe resaltar que un 10% de los pacientes que presentan una clínica característica del SA no presentan ninguna de las alteraciones descritas. En estos casos el diagnóstico es clínico. Para un laboratorios es necesario disponer de un protocolo de estudio genético para confirmar el diagnóstico clínico y conocer la etiología. El hecho de diferenciar las distintas etiologías; deleción, disomía uniparental paterna, defecto de impronta, mutación en el gen UBE3A o posibles reorganizaciones cromosómicas, permite ofrecer un consejo genético y establecer un valor pronóstico de la enfermedad. Para el desarrollo de este protocolo es necesaria la coordinación interdisciplinar entre especialistas clínicos y de laboratorio. Esta coordinación conlleva a un completo estudio clínico y molecular de los pacientes con sospecha clínica de SA según los conocimientos actuales del síndrome. Protocolo diagnóstico: - Cariotipo: Se realiza a todos los pacientes con sospecha clínica de SA. Permite el estudio de reorganizaciones cromosómicas que afectan a la región 15q11-q13. El análisis de deleciones mediante esta técnica es complejo y podrían diagnosticarse falsos positivos y negativos, por lo que es recomendable realizar la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) empleando sondas específicas. - Test de metilación (MPCR): Técnica de cribaje que se realiza a todos los pacientes, y permite confirmar el diagnóstico del síndrome causado por una deleción, una disomía uniparental paterna o un defecto de impronta, pero no permite diferenciar entre estas etiologías. Esta técnica consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) posterior al tratamiento del DNA genómico con bisulfito sódico. El bisulfito sódico convierte las bases del DNA llamadas citosinas en otras distintas llamadas uracilos, si dichas citosinas no se encuentran metiladas. Esta estrategia permite diferenciar el alelo materno (metilado) y el paterno (no metilado). Un patrón de metilación normal será aquel en el que se obtengan ambos alelos, y un patrón de metilación característico del SA, será aquel en el que sólo se obtenga producto del alelo paterno, ya sea porque existe una deleción del materno, porque ambos son paternos (disomía uniparental) o porque el materno no presenta metilación, es decir, ambos alelos presentan impronta paterna (defecto de impronta). Para diferenciar entre deleción, disomía uniparental o defecto de impronta se han de aplicar técnicas de FISH y/o análisis de microsatélites. - FISH: Dado que el 70% de los casos con SA son causados por deleción, en los casos que presentan un resultado positivo en el test de metilación se prosigue el estudio mediante la técnica de FISH. Esta técnica permite analizar la presencia de la región 15q11-q13 en ambos cromosomas 15, empleando sondas de DNA específicas de dicha región (D15S10) marcadas con fluorocromos. La observación de los dos cromosomas se realiza mediante un microscopio óptico de fluorescencia. - Análisis de microsatélites: En los casos que la deleción no está presente se realizará el análisis de microsatélites. Esta técnica permite diferenciar si ambos cromosomas provienen del mismo origen parental (los dos provienen del padre o si su origen es biparental (un cromosoma proviene del padre y el otro de la madre). En el primer caso podemos confirmar que se trata de una disomía uniparental paterna y en caso de obtener un resultado que confirme herencia biparental, el diagnóstico será por un defecto en la impronta. - Cribaje del gen UBE3A: En el caso de obtener un patrón normal mediante el test de metilación, se debe proseguir el estudio realizando una secuenciación del gen UBE3A. Actualmente dicho análisis se lleva a cabo mediante secuenciación directa y comparando la secuencia de bases del paciente con la secuencia normal del gen. Referencias: - Cassidy SB, Dykens E, Williams C. Prader-Willi and Angelman syndroms: sister imprinted disorders. Am J Med Genet 97: 136-146, 2000. - Kishino T, Lalande M, Wagstaff J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genet 15: 70-73, 1997. - Malzac P, Webber H, Moncla A. mutatons analysis of UBE3A in Angelman syndrome patients. Am J Human Genet 62: 1353-1360, 1998. - Matsuura T, Sutcliffe J, Fang P. De novo truncation mutation in E6-AP ubiquitin-protein ligase gene (UBE3A) in Angelman syndrome. Nature Genet 15:74-77, 1997. - Zeschnigh M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Kum Genet 5:94-98, 1997. - Kuwano A, Mutirangura A, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Saitoh S, Niikawa N. Molecular dissection of the Prader-Willi/Angelman syndrome region (15q11-q13) by YAC cloning and FISH analysis. Hum Mol Genet 1:417-425, 1992. - Mutirangura A, Greennerg F, Butler M, Malcolm S, Nicholls R, Chakravarti A, Ledbetter D. Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy. Hum Mol Genet 2:143-151, 1993.
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